分子诊断——体外诊断技术发展的飞跃
发布时间：2017-7-14
自公元前300年，希波克拉底提倡尿液检查诊断疾病以来，距今已有2300余年的历史，但真正在临床上能够发挥重要作用的实验室检查不过数百年时间，主要原因是受限于体外诊断技术的发展与应用。没有相应的科技进步和发展，实验室检测不可能取得突破。所幸的是，近百年来体外诊断技术取得了令人瞩目的重大发展。目前，实验室检查对诊断、治疗、预后等临床医疗决策的贡献度越来越高，尤其是近年来分子诊断技术的飞速发展，使得体外诊断技术再次实现革命性突破，分子诊断技术已覆盖了肿瘤[1]、遗传病[2]、血液病[3]、感染性疾病[4]、神经精神性疾病[5]、器官移植[6]、出生缺陷[7]等多个领域，其检查结果对机体易感性评估、疾病诊断、预后、治疗监测、个体化药物治疗、遗传咨询、健康管理以及家庭生育计划制定等均具有重要的参考价值甚至决定性价值。医学实验室的重要性比历史上任何时候都更加突显。
回顾历史，体外诊断技术的发展可谓既蜿蜒曲折，又引人入胜。公元1300年，尿检在欧洲普及(此时距希波克拉底提倡尿检已过去了1 600年时间)。公元1500年，内科医生开始使用尿液颜色比对图进行直观尿液分析，1590年荷兰显微镜学家、微生物学家安东尼·列文虎克(Antony van Leeuwenhoek，1632—1723)利用自制的显微镜首次发现了微生物，观察到肌纤维和微血管中血流，并于1684年出版了世界上第一本显微镜观察下的细菌绘图。1660年意大利学者Malpighi应用最原始的显微镜观察到人类红细胞，开辟了医学领域中细胞形态学检查的先河。至此，以形态学检查为主的实验活动已渐渐成型，医学实验的基础逐步奠定。
化学技术的发展为体外诊断技术带来一次革命性的进步，从此，实验室检查不仅仅是单纯的形态学观察和描述了，实验室检验的内容和其临床意义得到很大的丰富和发展。随着化学的发展和一些先驱在生命科学领域的尝试，人们认识到人体组织的某些现象可用化学方法识别，且这些现象对疾病诊断有帮助。这种"化学标志"具有与其他临床症状和体征同样的价值[9]。
体外诊断技术的第二次革命源于人类对"酶"的认识和酶学技术的发展，1773年，意大利科学家学者斯帕兰扎尼(Spallanzani，1729—1799)推断胃液中一定含有某种消化肉块的物质。1833年，法国学者培安和培洛里发现淀粉酶。1836年，德国马普生物研究所科学家施旺(Schwann，1810—1882)从胃液中提取出了消化蛋白质的物质-胃蛋白酶，解开了消化之谜。1897年，德国化学家毕希纳证明了活体酵素与非活体酵素的功能是相同的。并获得了1907年诺贝尔化学奖。20世纪30年代，科学家们相继提取出多种酶的蛋白质结晶，并证实酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。20世纪80年代，美国科学家切赫(Cech，1947— )和奥尔特曼(Altman，1939—)发现少数RNA也具有生物催化作用。1938年，Somogyi发明了血清和尿液的淀粉酶临床检验方法，Gutman发明了第一个酸性磷酸酶的检验方法，1954年，Kuby发明了血清肌酸磷酸激酶活性的实验室方法，1955年，Wroblewski和LaDue发明了血清乳酸脱氢酶的检验方法，Karmen发明了天冬氨酸转氨酶的检验方法。不仅仅是酶自身的测定，人体中一些其他化学成分如血糖的测定，也充分利用了酶的作用：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的生成速率与葡萄糖浓度呈正比，在波长340 nm监测吸光度升高速率，从而可以计算出血清中葡萄糖浓度。这些设计精细的反应，足以反应酶学技术对体外诊断带来的影响。
免疫学的发展和免疫技术的应用无疑为体外诊断技术带来第三次革命。1905年Bechtold发现了免疫扩散的原理。1950年R.S.Yalow和FamineS. Berson发明了放射免疫分析法，1952年Poulik博士发明了免疫电泳，1959美国化学家R.S.耶洛和S.A.贝尔森提出利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法，又称竞争性饱和分析法。他们因此获得1977年的诺贝尔生物医学奖。1967年，Abelev证明用患者血清中提取的α-甲胎球蛋白可以检验患者是否患有睾丸恶性肿瘤。1971年瑞典学者Engvail和Perlmann，以及荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道了体液中微量物质的固相免疫测定方法ELISA。1975年单克隆抗体杂交瘤技术的问世。在此基础上大量的单克隆抗体被制备出来，并广泛应用于临床。1980年，D.Colcher发现了CA-72血清肿瘤标志物，主要应用于检测直肠结肠癌。1981年，H.Koprowski发现了CA199，作为血清肿瘤标志物主要是为了检测胰腺癌，R.C.Bast发现了CA125应用于检测卵巢癌。在之后的数十年里，这种采用抗原-抗体结合原理建立的各种检测方法在临床上广泛应用，不仅用于测定机体自身的免疫功能，还能广泛用于检测各种肿瘤标记物、自身抗体、感染性疾病标志物、激素等。
分子诊断技术的迅猛发展无疑是体外诊断技术第四次革命，1953年Watson和Crick提出脱氧核糖核酸的双螺旋结构模型可谓是里程碑式的成果，为分子生物学的发展和分子诊断技术的进步奠定了坚实的理论基础。他们与Wilkins因此分享了1962年的诺贝尔医学奖(此处值得一提的是Rosalind Franklin 1920—1958，她率先拍摄到的DNA晶体照片，为双螺旋结构的建立起到了决定性作用。但遗憾的是她并没等到分享荣耀)。随后分子生物学的研究进展可谓精彩纷呈，新技术新方法的研发以超乎想象的速度问世。自20世纪70—80年代，各种核酸杂交技术发展成熟并广泛应用。具有代表性的是斑点杂交(dot blot)、southern blot、northern blot和原位杂交(in situ hybridization)，以及各种标记技术比如核素标记、荧光标记等在各实验方法上的应用。1971年Khorana提出核酸体外扩增的设想，但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。1985年，美国科学家Kary Mullis经过两年的努力，发明了PCR技术，也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。同期取得进展的另一项非常重要的技术是DNA测序技术，20世纪70年代末，美国生物化学家Walter Gilbert发明化学法、英国生物化学家Frederick Sanger发明采用同位素标记的双脱氧终止法手动测序技术，使人类测定基因序列成为可能。两位学者也于1980年获得诺贝尔化学奖。80年代中期，自动测序仪问世(应用双脱氧终止法原理、采用荧光素代替同位素并使用计算机图像识别)，90年代中期，人们对DNA测序仪进行重大改进、采用集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳，随后发展出成本更低，通量更高，准确度更高、速度更快的高通量测序技术(high-throughput sequencing)，又称"下一代"测序技术("next-generation"sequencingtechnology)，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。在其发展过程中具有代表性的主要有大规模平行签名测序(massively parallel signature sequencing, MPSS)、聚合酶克隆技术(Polony Sequencing)、454焦磷酸测序(454 pyrosequencing)、Illumina Solexasequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序(ion semiconductor sequencing)、DNA纳米球测序(DNA nanoball sequencing)等。目前，DNA测序可进行全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)、外显子测序、转录组测序、非编码RNA(如miRNA)测序、甲基化测序等，新技术的应用，使人们对许多物种的基因组，包括外显子、非编码区、转录组和基因拷贝数变异有了更深入、更全面的认识。对生物性状、疾病的解析也取得了重大的突破。在基础生物学研究和在众多的应用领域，如医学诊断，生物技术，法医生物学，系统生物学等中DNA测序已成为不可缺少的技术。除上述具有里程碑意义的进展外，分子生物学发展过程中，尤其重大的成就是作为人类历史上最伟大的三大科学计划之一的人类基因组计划的提出以及人类基因组序列图的完成(另两个为曼哈顿原子弹计划和阿波罗登月计划)，以1999年12月，第22号染色体测序完成开始[10]，至2006年5月，1号染色体测序完成结束[11](余为2000年5月，21号染色体测序完成[12]；2001年12月，20号染色体测序完成[13]；2003年2月，14号染色体测序完成[14]；2003年6月，Y染色体测序完成[15]；2003年7月，7号染色体测序完成[16]；2003年10月，6号染色体测序完成[17]；2004年4月，13号和19号染色体测序完成[18,19]; 2004年5月，9号和10号染色体测序完成[19,20]; 2004年9月，5号染色体测序完成[21];2004年12月，16号染色体测序完成[22]; 2005年3月，X染色体测序完成[23]; 2005年4月，2号和4号染色体测序[24,25]; 2005年9月，18号染色体测序完成[26];2006年1月，8号染色体测序完成[27]; 2006年3月，11号，12号和15号染色体[28,29,30]；2006年4月，17号和3号染色体测序完成[31,32])，标志着人类已解开自身基因组的全部序列。该计划的完成对社会发展和人类自身影响的重要性无论怎样强调都不过分，对医学实验的巨大影响是进一步带动分子诊断技术的飞速发展。
除各种核酸分析技术外，质谱技术近年来也取得突飞猛进的发展，因为是检测特征性的小分子，有些专家把质谱技术归类到广义的分子诊断技术中。其基本原理是测量离子电荷/质量比，首先使样品中各组分发生电离，生成不同荷质比的离子，然后经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，最后将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。世界上第一台质谱仪是英国物理学家、化学家Francis William Aston(1877—1945)于19世纪20年代研制成功，他用这台装置发现了多种元素同位素，研究了53个非放射性元素，发现了天然存在的287种核素中的212种等，并为此荣获1922年诺贝尔化学奖。目前，液相色谱质谱联用仪，电感应耦合等离子体质谱仪，富立叶变换质谱等已比较成熟。质谱分析法已广泛地应用于化工、能源、药物、刑侦、医学等各个领域。用于生物医药领域的质谱具有灵敏度高、选择性强、准确性好等特点，在检验医学中可用于组分序列分析、结构分析、分子量测定、组分含量测定等。现已应用于核酸的检测分析、小分子生物标志物的检测、大分子生物标志物检测、微生物鉴定、药物分析等。
目前，分子诊断技术以其具有的灵敏度高、特异性强、简便快速、可进行定性、定量检测等优势，已广泛应用于疾病的预测、预防、预后、个体化药物治疗、产前筛查、遗传性疾病、肿瘤、感染性疾病(包括细菌性感染、病毒性感染、寄生虫、真菌、人畜共患疾病等)、神经精神性疾病等多个领域。实验室检测对临床医疗决策的贡献度进一步提升，检验结果的重要性也达到空前的高度。许多检测结果已不仅仅是"辅助诊断"了，而是对临床医疗决策具有决定性的意义。但事物的发展总是具有两面性的，实验室检测结果对临床重要性的提高，同时也不可避免的伴随着实验室面临风险的提高，除了直接影响医疗决策外，还伴随着临床医护和患者对实验室检测的期望值提高和检测质量要求的提高。2015年8月，美国华盛顿州终审法院对一起由于染色体核型分析报告错误引起的医疗纠纷，经过长达5年的诉讼后，最终判罚承担检测的医疗机构和实验室5 000万美元的天价赔偿，为医学实验室提供了一个鲜活的风险教育案例。医学实验室需进一步加强风险意识和风险管理，提高质量管理水平，从检测前、中、后每个环节切实规范管理和操作。让"每一个检测数据都关乎一个生命"的理念深入到每名检测人员的意识里和每个操作流程的环节中。也只有如此，才能使医学实验室的管理、质量和能力与当代医学发展和科技进步相适宜，与临床诊断、治疗、预后、预测和健康管理等要求相适宜。
来源:中国体外诊断网
